بحث هذه المدونة الإلكترونية

جارٍ التحميل...

الأربعاء، 15 سبتمبر، 2010

احدث الطرق لاكثار النباتات ( زراعة الانسجة النباتية ) - الجزء الثالث

 اساسيات الزراعة بالانسجة
5 - أساسيات الزراعة بالأنسجة

أولاً: العمل فى جو معقم Aspect work


تشتمل زراعة الأنسجة على عزل وزراعة خلايا منفردة أو أنسجة أو أعضاء نباتية من أجزاء النبات وزراعتها على بيئة غذائية سائلة أو شبه صلبة تحتوى على مكونات متكاملة حيث تشمل مصدر للكربون فى صورة السكريات مثل السكروز ومصدر للعناصر الكبرى والصغرى مثل النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم والكالسيوم والماغنسيوم والكبريت والحديد والمنجنيز والنيكل والكوبلت والزنك والنحاس والبورون والمولبيدنيم. كذلك تحتوى البيئة الغذائية على الفيتامينات والهرمونات بتركيزات متوازنة مما جعل البيئة الغذائية وسط ملائم لعديد من الفطريات والبكتريا التى تنتشر فى الجو والتى يمكن لها أن تتطفل على تلك البيئة الغذائية الغنية مما يؤدى إلى تلوثها لذلك كان من الواجب أن يتم تعقيم البيئة قبل استخدامها فى الزراعة وتعقيم الأدوات المستعملة وكذلك تعقيم الأنسجة " المنفصل النباتى " Explant المنزرعة فضلاً على اتمام الزراعة فى جو خالى من الكائنات الدقيقة التى تؤدى إلى تلوث تلك الزراعات وذلك بإتمام العمل داخل غرفة معقمة أو كابينة معقمة Clean Environment .

ثانياً: التحكم فى الجو البيئى Environment Control

بعد إتمام عملية عزل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء النباتية وزراعتها على البيئة الغذائية المناسبة يجب أن تحضن فى جو ملائم تتوفر فيه نسبة الرطوبة الملائمة ودرجة الحرارة وشدة الإضاءة المناسبة لذلك يجب توفر غرفة تحضين أو حضانة يمكن التحكم فى درجة حرارتها وشدة إضاءتها. كذلك يجب أن تشتمل على أرفف لوضع حوامل الأنابيب أو الدوارق وتعرض تلك الأرفف إلى إضاءة مناسبة حسب مرحلة الزراعة وتزود وحدة الإضاءة بميقاتى للتحكم فى طول فترات الإضاءة .

ثالثاً: الإمكانيات المعملية Laboratory Facilities

1- استعدادات النظافة Provision of clean

يجب أن يكون هناك إمكانيات عالية لنظافة معمل زراعة الأنسجة ومداومة ذلك بشكل روتينى يومى حتى يتحقق النجاح باستمرار فى استخدام هذا التكنيك بكفاءة عالية، ويتم ذلك بشفط الأتربة ميكانيكياً ومسح وترطيب الأرضيات وتنظيف المناضد والنوافذ والحضانات والثلاجات تنظيفاً جيداً. كذلك يجب غلق الأبواب غلقاً محكماً. كذلك يجب أن تكون الجدران والأرضيات والأسطح جميعها ناعمة الملمس سهلة التنظيف ويفضل أن تصنع أسطح المناضد Bench Surface من مادة الفورميكا Formica .

2- عمليات الغسيل Washing up

يجب أن تتم عمليات غسيل الأدوات والزجاجيات والدوارق والأنابيب غسلاً جيداً باستعمال الماء الدافئ لذلك يجب أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على مصدر للماء الدافئ فضلاً على ماء مقطر وذلك لشطف الزجاجيات به ولاستعماله فى تحضير البيئات. ويفضل الماء المقطر مرتين والمعروف باسم Double distilled water كذلك يفضل استخدام الماء الخالى من الأملاح خاصة الصغرى منها لسميتها للأنسجة الرهيفة المزروعة مثل النحاس لذلك يستعمل الماء المعاد تقطيره والمعروفة De-ionizer وفى حالة عدم توافر تلك الإمكانيات يمكن أن يمرر الماء المقطر مرتين على مرشح ايونى Ion exchange لفصل الأملاح المتأينة على الرزين وبذلك نحصل على ماء مقطر لثلاث مرات Triple distilled water وعند الرغبة فى تخزين الماء المقطر يجب أن يكون ذلك فى آنية مغطاة زجاجية أو بلاستيكية محكمة ويفضل عدم استعمال الماء المخزون لفترة طويلة حتى لا يكون قد تلوث بالطحالب والفطريات ويجب غسيل آنية الماء دورياً The containers should be cleaned regularly . ولعمليات الغسيل يجب أن يتوفر لها صوانى بلاستيكية Plastic bowls or plastic bucket وذلك لنقع الأنابيب والزجاجيات والأطباق البترى فيها فترة قبل الغسيل بالفرشاة . وبعد الغسيل تشطف عدة مرات بالماء المقطر وتترك عندئذ لتصفية الماء على الحوامل ثم تجفف بعد ذلك فى الفرن قبل تخزينها فى دولاب الزجاجيات لحمايتها من الأتربة.

ويفضل أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على ماكينة أتوماتيكية للغسيل Automatic washing machine لإجراء عمليات الغسيل الدورى ولتسهيل العمل ويجب الأخذ فى الاعتبار أن الغسيل اليدوى يفضل فى بعض الحالات . ويجب التخلص من النفايات والزجاج المكسور والبيئات الملوثة بعد تعقيمها بالأتوكلاف وذلك باستعمال أكياس من البلاستيك ذات الحافة المغلقة لكى تغلق باستمرار وتستبدل يومياً لتقليل التلوث بالمعمل والمحافظة على نظافته.



3- إعداد البيئة وتخزينها Media preparation and storage

تحضر البيئة الغذائية كما سبق الذكر من الأملاح المعدنية والفيتامينات والهرمونات والسكر بالإضافة إلى الأجار وعادة تحضر البيئة فى صورة Stocks عالى التركيز من كل من الأملاح والفيتامينات والهرمونات . وذلك يرفع تركيز تلك المواد إلى عشرة أضعاف × 10 أو مائة × 100 وتخزن تلك الـStocks فى زجاجات داكنة اللون أو فى قنينات زجاجية أو بلاستيكية Glass plastic vials وذلك داخل أماكن باردة وتشمل ثلاجة كهربائية، أو مبرد تحت الصفر (- 20 °م) Deep freezer أو تخزن فى مجفف Desecrator أو فى غرفة مبردة تحتوى على أرفف لتخزين البيئات الجاهزة أو الـ Stocks . ولتجهيز تلك البيئات يجب استعمال موازين دقيقة حساسة لوزن مكونات البيئة الدقيقة كذلك يجب استعمال مقلب مغتاطيسى Magnetic hot plate stirrer لتقليب الأملاح والفيتامينات والهرمونات أثناء إذابتها .

4- قياس الرقم الهيدروجينى Determination of PH

كثير من العمليات الفسيولوجية تؤدى إلى تغير الرقم الهيدروجينى داخل الخلية وهذا التغير يؤثر فى تلك العمليات ولهذا فإن فهم الرقم الهيدروجينى PH يعتبر مهماً فى مجال زراعة الأنسجة ومن المهم أن يكون واضحاً أن ذلك التغير يجب أن يكون طفيفاً لكى لا تتأثر الخلايا و تفقد مقدرتها على الاستمرار فى فعاليتها ونشاطها.

والرقم الهيدروجينى هو مقياس لتركيز أيون الهيدروجين فى محلول ما يعرف بأنه اللوغاريتم السالب للأساس عشرة لفاعلية ذلك الأيون –Log 10 والرقم الهيدروجينى لسيتوبلازم الخلايا يختلف من 6:6.5 أما عن الفجوات العصارية فهى ذات رقم هيدروجينى حمضى إذ يبلغ 1.5 : 2 فى أوراق البيجونيا فى حين أنه 5.5 فى أوراق الليمون. ولكن الرقم الهيدروجينى للخلايا البرنشيمية فى الجذور والسيقان 5.5 : 6 ويرجع ميل تركيزات أيون الأيدروجين ناحية الحموضة داخل الخلايا النباتية إلى احتوائها على الأحماض العضوية Organic acids والتى تختلف فى درجة تفككها وكذلك فى احتوائها على المجموعات الكربوكسيلية التى تتفكك , فحمض الماليك مثلاً يحتوى على مجموعتين بينما حمض الستريك يحتوى على ثلاث مجموعات . فالرقم الأيدورجينى للسيتوبلازم كما نرى غير منخفض ويرجع ذلك إلى إحتواء الخلية على القواعد والمجموعات التى يمكن أن تتحد بالبروتينات المتفككة من تلك الأحماض مثل البيكربونات والفوسفات ومجموعات أمينية ولو أن الأخير لا يعد قاعدة قوية لذا فإن المجموعات السابقة تعمل على الإتحاد بالبروتينات المتفككة من الأحماض العضوية وبالتالى فهى تعمل كنواتج Buffers فسيولوجية لزيادة الرقم الهيدروجينى فى سيتوبلازم الخلية وبهذه الميكانيكية تعمل الخلايا على المحافظة على رقم هيدروجينى ثابت .

لذا يجب ضبط PH البيئة الغذايئة عند درجة تركيز هيدروجينى مناسب يلائم امتصاص تلك الخلايا للمواد الغذائية واستمرار نموها ونشاطها على تلك البيئة حيث أن زراعة النسيج على بيئة ذات PH منخفض فى أى من الجهتين فإن ذلك يؤدى إلى انخفاض درجة تشبع الأنزيمات بالمواد المتفاعلة Substrate وقد تفقد الأنزيمات نشاطها نتيجة تغير حالة التأين للمراكز النشطة بالأنزيمات وبالطبع فإن فقد الأنزيمات لنشاطها تفقد الخلايا نشاطها أيضاً . لذلك يجب استخدام جهاز جيد لضبط الرقم الهيدروجينى ومعايرته من آن لآخر باستخدام Buffer solution حديث التحضير ، ويعتمد جهاز PH meter على اختلاف فرق الجهد الكهربى بين المناطق المختلفة فى نشاط أيوناتها المشحونة حيث يغمر إلكترود الجهاز فى محلول البيئة لقياس PH ويعدل ذلك الرقم بإضافة عدة نقط من حامض أو قلوى معلوم العيارية .

5- التعقيم Sterilization

تعقم عادة الأدوات والزجاجيات التى تستخدم فى الزراعة مثل الأطباق البترى والكئوس والماصات ورقائق الألمونيوم والشاش..إلخ وتعقم الزجاجيات داخل الفرن على درجة حرارة 160 – 180 م لمدة 1.5 : 2 ساعة مع تغليفها بورق الألومنيوم ثم بعد التعقيم تنقل إلى غرفة أو كابينة الزراعة ، أما البيئات الغذائية فعادة تعقم داخل الأتوكلاف على درجة 121 م لمدة 15 دقيقة و الأتوكلاف جهاز للتعقيم يحتوى على إناء من الصلب يتحمل الضغط وتعتمد فكرة التعقيم وعليه ترتفع معها درجة غليان المحلول وبذلك لا تغلى المحاليل داخل الأتوكلاف حيث يصاحب ارتفاع الضغط ارتفاع مصاحب فى درجة الغليان ودرجة الحرارة 121 م عند 1.2 ضغط جوى وهى درجة كافية لقتل الكائنات الدقيقة، ويترك الجهاز دون فتح البخار حتى ينخفض الضغط داخله ليتعادل مع الضغط الجوى وإلا تطايرت أغطية الأنابيب وأدت درجة الحرارة العالية إلى غليان محاليل البيئة .

تعقم بعض المواد التى يمكن أن تتأثر بحرارة الأتوكلاف مثل حمض الجبرلين والأنزيمات المستخدمة فى تحليل جدر الخلايا عند زراعة البروتوبلاست باستخدام فلتر خاص لا يسمح بمرور الكائنات الدقيقة وتستقبل المادة المعقمة داخل أنابيب معقمة أيضاً ثم يتم حقن كل أنبوبة بقدر مناسب من المادة المعقمة بالترشيح للبيئة الغذائية السابقة التعقيم بالأتوكلاف.

ويجب أن تكون البيئة غير صلبة وعليه أن يتوفر بمعمل زراعة الأنسجة حمامات مائية أو ميكروويف لصهر البيئة حتى يمكن خلط المواد ( مثل الجبرلين ) المعقم بالترشيح بباقى البيئة التى يجب ألا يزيد درجة حرارتها عن 40 درجة مئوية . ولإتمام عمليات التعقيم بسهولة ويسر يجب توفر سلات لنقل الأنابيب والدوارق داخل الأتوكلاف . كذلك يجب توفر صوانى وحوامل أنابيب ووسائل تعليم الزجاجيات حتى لا تختلط وتفقد هويتها بعد الخروج من الأوتوكلاف .

6- الزراعة والنقل Culture incubation and transfer

عزل وزراعة الخلايا أو الأنسجة يجب كما سبق الإشارة إليه أن يتم فى جو غاية فى النظافة ويمكن أن يتم ذلك باستخدام كابينة Laminar air flow مزودة بفلتر يمرر خلاله هواء مضغوط يؤدى إلى خروج الهواء لحيز الكابينة وهو خالى من الكائنات الدقيقة التى تتواجد فى الهواء العادى ، وبالطبع يجب أن توضع كابينة العزل فى مكان نظيف ويفضل أن تكون حجرة ذات أبواب مزدوجة Double sliding doors وذلك لتقليل الأتربة Atmospheric duct فى جو حجرة العزل .

وعادة للمحافظة على فلتر كابينة العزل ينظف من آن إلى آخر وذلك بشفطه ميكانيكياً أو غسله، وتزود كابينة التعقيم بمصدر للإضاءة وكذلك مصدر للكهرباء لتوصيل الميكروسكوب عند الرغبة فى استخدامه ولزيادة الحيطة وخوفاً من التلوث يستخدم القائم بالعمل قفازات بلاستيكية كما يمكن استخدام ملابس معقمة خاصة بالعمل، وترجع أهمية القفازات إلى حماية البشرة من الجفاف الناتج من استخدام الكحول فى تعقيم الأيدى قبل إجراء الزراعة، كذلك تستخدم الملابس المعقمة لتقليل التلوث من الملابس الشخصية للقائم بالعمل.

وتستخدم أدوات العزل وفصل الأنسجة Surgical instruments مثل الملاقط Forceps ، ملعقة الصيدلى Spatula ، الإبر Needles ، المشرط Scalpel ، المقص Scissor فى فصل Explant ونقلها على سطح البيئة الغذائية وتعقم تلك الأدوات باستخدام Sterilizer الخاص بذلك أو بغمس الأدوات فى كحول وحرقها على النار باستخدام موقد كحولى Spirit lamp أو موقد بنزين Bunsen burner كذلك يجب وضع رشاشة كحول Spray bottle of alcohol لرش الكحول على أسطح كابينة العزل لتعقيم اسطحها فى بداية العمل ويترك الجهاز لمدة نصف ساعة للتأكد من نظافتها قبل استعمالها .

7- التحضين Culture incubation

تحضن الأنابيب أو الدوارق داخل حجرة ذات أرفف أو داخل حضانة متسعة ومزودة بالإضاءة والحجرة تحتوى على مكيف للهواء للتحكم فى درجة الحرارة وتزود حجرة التحضين بقاطع للتيار الكهربى Cut out device ومنبه Alarm bell يعمل إذا ارتفعت درجة الحرارة أكثر من المعدل المطلوب بدرجتين إلى ثلاث درجات مئوية وتزود حجرة التحضين بهزاز Shaker لتوفير التهوية للبيئات السائلة كما تزود حجرة التحضين بميقاتى Timer switch لتحديد زمن الإضاءة والإظلام وعادة ما تتعرض الزراعات لمدة 16 ساعة إضاءة يومياً وثمان ساعات إظلام أما بالنسبة للرطوبة فيجب ألا تزيد عن 70 % وذلك لأن زيادتها تزيد من فرص التلوث ونقصها أيضاً غير ملائم نظراً لإسراع البيئة الغذائية Drying out of culture medium .

8- عملية النقل للجو الخارجى In vivo transfer

تنقل النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة إلى الجو الخارجى تدريجياً بدأ بالصوبة الزجاجية Glasshouse أو Screen house أو داخل أحواض خاصة Horticultural propagator ثم إلى الحقل . والتدرج فى الانتقال هام حيث أنه ينقل نباتات نامية فى جو مائى أوشبه مائى إلى جو عادى لذلك يجب أن تعامل النباتات معاملات التقسية التى من شأنها أن تتيح للنباتات مقدرة على تحمل الظروف خارج الأنبوبة وذلك بتعريض النباتات لشدة إضاءة تصل إلى 10000 Lux مع فتح الأنابيب عدة مرات قبل نقلها ثم تنقل النباتات مباشرة إلى أصص بلاستيك أو Jiffy 7 مملوء بمخلوط زراعى مناسب معقم Sterilized compost وتنقل النباتات إلى الصوبة تحت رى رزازى Mist أو داخل الأحواض ذات الأرضية الشفافة أو توضع الأصص داخل أكياس من البلاستيك ثم تدريجياً تقلل الرطوبة إلى الجو العادى ، أما عند تصدير النباتات Plantlets إلى الخارج عادة يستخدم تغليف خاص Polystyrene boxes وتفحص لخلوها من الأمراض قبل تصديرها .



6- ملخص لاحتياجات معمل زراعة الأنسجة

1- عام General

- تجهيزات كهربائية ومولد كهربائى للطوارئ

Generator Electric supply with emergency

- مصدر مائى Main water source

- مصدر للغاز Gas supply

- مكيف هواء Air condition

- مناضد Benching

- طفاية حريق Fire Extinguisher




2- الغسيل Washing up

- حوض مزدوج كبير الحجم Double sink large size

- مصدر مائى ساخن وبارد Hot and cold water supply

- حوامل للتجفيف Draining rack

- زجاجات للتنظيف Bottle brushes

- كابينة أو فرن للتجفيف Hot air drying cabinet or oven

- صندوق للنفايات Waste bins

- بالطو وقفازات Waterproof apron and gloves

- جمدانة مياه Glass / plastic covered containers for distilled water

- حامل للمناشف Towel holder

- منظفات وصابون Detergent , chemical decontaminant and soap

- ماكينة غسيل أتوماتيكية Glassware washing machine

- جهاز تقطير مياه بالفصل الكهربى Water de-ionizer


3- إعداد البيئة وتخزينها media preparation and storage

- أرفف للكيماويات Shelves for chemicals

- دولاب للكيماويات Chemical capboard

- ثلاجة Refrigerator

- مبرد تحت الصفر Deep Freezer

- مجفف Desiccator

- ميزان حساسيته 0.1 مليجرام Balance accurate to 0.1 mg

- قوارب للوزن Weighing balance boat

- معلقة الصيدلى Spatula

- مقلب مغناطيسى Magnetic stirrer / hot plate

- جهاز تقدير أيون الأيدروجين PH meter with buffers and adjusting solution


- ترمومتر Thermometer

- دوارق مخروطية Conical flask 100, 250, 500, 1000 ml

- دوارق مخروطية Volumetric flask 100

- كاساتBeckers 1000 – 2000 ml

- أقماع Funnels

- مضخة ماء Water jet pump

- ماصة مدرجة Graduated pipettes 1, 2, 5, 10 ml

- ماصة أتوماتيكية Automatic pipettes

- سرنجة Syringe

- زجاجات الزراعة Culture vessels , tubes, flasks bottles

- سبت سلك Wire baskets for carrying bottles and tube

- أتوكلاف Autoclave

- صوانى Trays

- ورق ألومنيوم Aluminum foil

- قلم للكتابة على الزجاج ضد الماء Waterproof makers

- حمام مائى Water bath

- جهاز طرد مركزى Low speed centrifuge


4- أدوات عزل وزراعة الأنسجة Culture incubation and transfer instrument

- ماصة أتوماتيكية Automatic pipettes

- سرنجة Syringes : 1 ml, 10 ml, 20 ml

- زجاجات الزراعة Culture vessels , tubes, flasks bottles

- زجاجات ذات قمة لوبية Glass screw tap battles ; 250 , 500 , 1 ml

- قنينة بلاستيك Plastic vials : 10 ml , 20 ml

- سبت بلاستيك Wire baskets for carrying bottles and tube

- أتوكلاف Autoclave

- صوانى Trays

- ورق ألومنيوم Aluminum foil

- قلم للكتابة على الزجاج ضد الماء Waterproof makers

- فرن حرارى للتعقيم Heat sterilizing oven

- حمام مائى Water bath

- جهاز طرد مركزى Low speed centrifuge

- حلة ضغط Pressure ****e


5 - أدوات عزل وزراعة الأنسجة Culture incubation and transfer instrument

- كابينة عزل Laminar air flow cabinet

- مشرط Scalpel

- معلقة الصيدلى Spatula

-الإبر Needles

- مقص Scissors

- موقد كحولى Spirit lamp

- ميكروسكوب بمصدر ضوئى Dissecting microscope

- قفازات Gloves

- بارافيلم Para film

6- التحضين Incubation

- حجرة أو كابينة متحكم فيها درجة الحرارة والرطوبة Room cabinet with temperature and humidity control


- أرفف مضاءة Shelving with light

- حوامل أنابيب Test tube racks

- هزاز Shaker

- النقل الجوى للخارج In vitro transfer

- أصص Plant pots

- صوانى Trays

- علامات Plane labels

- حوض زراعة Horticultural propagator

- كاسات أو أكياس بلاستيك Beakers or plastic bags

- وسط للزراعة Compost

- سماد سائل Liquid fertilized

- جهاز الرى الرزازى Mist propagator or high humidity chamber

الثلاثاء، 14 سبتمبر، 2010

احدث الطرق لاكثار النباتات ( زراعة الانسجة النباتية ) - الجزء الثاني

 بيئات زراعة الانسجة

4- بيئة زراعة الأنسجة Tissue culture media

تختلف البيئة المناسبة لزراعة الأنسجة تبعاً لاختلاف النسيج المستعمل وطور النمو اختلافاً كبيراً. لذلك فإن هناك العديد من البيئات الغذائية التى تسمح للباحث فرصة الاختيار من بينها وتتركب البيئة الغذائية من الأتى:

أ‌- الأملاح الغير العضوية Inorganic salts

تشمل العناصر الكبرى مثل النيتروجين ، البوتاسيوم ، الفوسفور ، الماغنسيوم ، الكبريت والعناصر الأخرى وتشمل الحديد ، المنجنيز ، النيكل ، الكوبالت ، الزنك ، والبورون ، المولبيدنيم. وهناك العديد من مخاليط الأملاح مثل مخلوط أملاح Murashige & Nitsch & Nitsch 1969, White 1963 Skoog1962 إلخ. ويمكن تعديل تركيز تلك الأملاح لتلائم الاحتياجات الخاصة لبعض الحالات ولحسن الحظ وجد أن كثير من النباتات وتقريباً كلا الأعضاء تتشابه فى احتياجاتها الغذائية من العناصر الكبرى والصغرى وقد نجحت بيئات N & N formula, MS formula, White formula فى زراعة العديد من النباتات .

وفى بعض الحالات يرغب فى زيادة تركيز الفوسفات الغير عضوى ويتم ذلك بإضافة 170 مليجرام / لتر من فوسفات الصوديوم الأحاديةNaH2Po4H2O

مبين في الاتي  عديد من المخاليط المستخدمة فى البيئات المختلفة.

Molecular weight of the compounds commonly used in tissue culture media

Compound
Chemical formula
Molecular weight
Macronutrients

Ammonium nitrate NH2NO4
80.04



Ammonium sulphate
(NH4)2SO4


132.15



Calcium chloride
CaCI2. 2 H2O


147.02



Calcium nitrate
Ca(NO3)2. 4H2O


236.16



Magnesium sulphate
MgSO4.7H2O


246.47



Potassium chloride
KCl


74.55



Potassium nitrate
KNO3


101.11



Potassium dihydrogen ortho-phosphate
KH2PO4


136.09



Sodium dihydrogen ortho-phosphate
NaH2PO4. H2O
156.01
Micronutrients

Boric acid H2BO2 61.83

Cobalt chloride CoCl2.6 H2O
237.93

Cupric sulphate CuSO4.5 H2O
249.68

Magnesium sulphate MnSO4.4H2
223.01

Potassium iodide
KI
l66.0l

Sodium molybdate Na2MoO4.2H2O
241.95

Zinc sulphate
ZnSO4.7H2O
287.54

Sodium EDTA
Na2EDTA.2 H2O

(C12H14N2O2Na2.2 H2O)
372.25

Ferrous sulphate

Ferric-sodium EDTA


FeSO4.7H2O

FeNa.EDTA

(C12H12FeN2NaO2)
278.03

367.07


Sugars and sugar alcohols

Fractose
C6H12O2
180.15

Glucose
C6H12O4
180.15

Mannitol
C6H14O4
182.17

Sorbitol
C6H14O6
182.17

Sucrose
C12H12O12
342.31
Vitamins and amino acids

Ascorbic acid (Vitamin C)
C6H2O4
176.12

Biotin (Vitamin H)
C12H14N2O2S
244.31

Calcium pantothenate (Ca salt of vitamin B,)
(C6H12NO3)2Ca
476.53

Cyanocobalamine (Vitamin B)
C12H22CoN14O14P
1357.64

L. Cysteine HCl
C2H2NO2S.HCI
157,63

Folic acid (Vitamin B Vitamin M)
C14H19N2O4
441.40

Lnositol
C6H12O
180.16

Nicotinic acid or Niacin (Vitamin B)
C6H2NO2
123.11

Pyridoxine HCl (Vitamin B)
C9H12NO2.HCl
205.64

Thiamine HCl (Vitamin B)
C12H17CIN4.OS.HCl
337.29

Glycine
C2H2NO2
75.07

L. Glutamine
C2H14N2O2
146.15

ب- السكريات Sugars

من الدراسات المبكرة فى هذا المجال البحث عن افضل مصادر الطاقة فى البيئة الغذائية افترض أن السكريات الأحادية كالجلوكوز سوف تكون فعالة ومقبولة كمصدر للطاقة ولكن White 1963 وجد أن السكروز يعتبر من أحسن المواد من جهة إنتاج الطاقة بالنسبة لجذور الطماطم ثم أشار Murashige & Shoog بأن هناك عدة سكريات خلاف السكروز يمكن استعمالها سواء كانت سكريات أحادية أو ثنائية أو ثلاثية مثل الجلوكوز والفركتوز والمانتوز والجلاكتوز والمالتوز و الرافنوز أما السرببول والمانيتول فقد وجد أن النبات لا يمكن استخدامها والاستفادة منها وقد وجد أن نسبة 2 إلى 4 % تكون ملائمة لزراعة الأجنة 50 % مناسبة لزراعة القمم النامية ، 7.5 % مناسبة لإجراء Micrografating

ج - الفيتامينات Vitamins

إحدى المكونات الهامة فى بيئات زراعة الأنسجة وعادة يستخدم فيها الفيتامين Thiamin ) V.B) وحمض النيكوتين Nicotinic acid والبيرودكسين Pyridoxine وهى جميعها مرافقات أنزيمية هامة كذلك يستخدم الريبوفلافين Riboflavin فى معظم مزارع المتوك ويشاطره فى الأهمية فيتامين البيوتين Biotin كما يستعمل الأنيوسيتول Inositol بتركيز 100 جزء فى المليون ، وهو من المواد الحيوية المنظمة وبالنظر لعدم وضوح متطلبات كل جزء نباتى من الفيتامينات للنمو وله صورتان Meso, Myo لذلك تضاف كأسلوب وقائى وتجنباً لاحتمالات التأثير فى طبيعة نمو تلك الأجزاء النباتية المزروعة فى الوسط الغذائى .

مبين بالاتي المخاليط المختلفة من الفيتامينات المستخدمة فى البيئات المختلفة

Some Vitamin Mixtures for Plant Culture Media ( Mg per L Medium)



Vitamin
Constabel

1958

(3)
Gambog

1908

(34)
Hendersom

Durrell&

Bonner

1952

(35)
Morel&

Wetmore

1951

(36)
Nickell&

Mnretzki

1909

(37)
Paeis&

Duhmet

1953

(38)
Reinert&

White

1950

(39)
White

1903

(33)

p-Aminobenzoic acid

0.2
0.05






Ascorbic acid
10
0.4







Biotin
0.1
0.00025
0.005
0.01
0.01
0.002
0.01


Choline chloride
10.0
0.2
0.1



10.0


Cyanocobalamin






0.0015


Folic acid
1.0
0.015
0.1


0.0003



Nicotinic acid
0.5
0.5
0.5
1.0
2.8
0.06
0.5
0.5

Calcium pantothenate
10.0
0.4
0.8
1.0

5.0
0.1


Pyridoxine hydrochloride

0.5
0.1
1.0
0.2
0.001
0.1
0.1

Riboflavin
0.1
0.015
0.05

0.2
0.001
0.1


Thiamine hydrochloride
0.1
0.5
0.1
1.0
0.03
0.005
0.1
0.1

د- الأحماض الأمينية والأميدات Amino acids and Amides

إضافتها للبيئة عادة ما يكون مفيداً خاصة الأرجنين وحمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك والتيروزين مبين لاحقا أهم الأحماض الأمينية والأميدات المستخدمة فى زراعة الأنسجة والمخاليط منها . وترجع أهميتها فى زيادة نمو الكلس وليس فى تكوين الأعضاء ويجب أن يستعمل التشابه الأيزوميرى L وليس D لتلك المركبات .

مبين بالاتي المخاليط المختلفة من الأحماض الامينية والاميدات المستخدمة فى البيئات المختلفة

Mixtures of Amino Acids and Amides

Employed in Plant Culture Media (ppm)



Amino Acid

or Amide


Constabel

1958
Furuhashi

&Yatazawa
Gamborag

1966
Nitsch

1974
Paris

&Duhamet

1953
Reinet

&White

1956
Torrey

&Reinert

1961

Alanine

115.0


30



Arginine
7.8
105.0
40

72
7.8
7.8

Asparagine


40


20.0
20.0

Aspartic acid

186.0


21
6.0
6.0

Cysteine
1.5
7.9


12



Cystine

1.5
1.5

Glycine
10.0
150.0
20


10.0
10.0

Glutamic acid
14.0
220.0


140
14.0
14.0

Glutamine


60
800

250.0
50.0

Histidine
2.6
46.5


12
2.6
2.6

Isoleucine
10.4
66.0



10.4
10.4

Leucine

145.0


18
15.6
15.6

Lysine
15.6
145.0


21
15.6
15.6

Methionine
13.0
14.9
30


13.0
13.0

Phenylalanine
15.6
83.0
20

8
5.0
2.5

Proline
5.0
61.0



5.0
5.0

Serine

95.0

100
9



Threonine
13.0
84.0



13.0
6.5

Tryptophan

10.4
40


4.0
4.0

Tyrosine

54.0


18
40.0
40.0

Valine
13.0
94.0



13.0
13.0
هـ- المواد الطبيعية

قد لا نستطيع توفير احتياجات الأجزاء المزروعة من الأحماض الأمينية بصورة دقيقة لذلك تضاف الاحماض الامينية فى صورة طبيعية كالآتى :

1- Hydrolyzed protein preparation : casein Hydrolysates, Soya peptone .

مستخلص الخميرة والشعير
2- Malt and Yeast extract

لبن جوز الهند، آندوسبرم الذرة 
3- Endosperm fluids ) Coconut, Corn )

لب الموز، عصير الموالح والطماطم 
4- Fruit juice ) banana, orange, tomato )

وعادة لا تستعمل المواد الطبيعية إلا فى حالة فشل البيئات فى آنماء النسيج أو عند الرغبة فى زيادة التأثير المنبه وهى عادة تحتوى على عديد من الفيتامينات والأحماض الأمينية.

و- منظمات النموPlant regulators
تعتبر منظمات النمو من أهم مكونات البيئة وبدونها قد لا نحصل على أى نجاح من زراعة الأنسجة والأعضاء والخلايا. وتشمل منظمات النمو المستعملة كل من الأوكسين والسيتوكيين بأنواعها المختلفة كما هو موضح لاحقا وترجع أهميتها إلى دورها فى انقسام واستطالة الخلايا وكذلك فى قدرتها على إحداث التخليق وتكشف الأعضاء المختلفة. يستخدم الأوكسين مثل 2,4-D , NAA, IAA لتكوين الكلس واستحداث تكون الاعضاء العرضية وقد وجد أن تأثير IAA ضعيفاً مقارنة بالأوكسينات الأخرى أما 2,4-D فكان أقواهم خاصة فى حثه على تخليق الأجنة العرضية أو تكوين الكلس . أما السيتوكينيات فيعتقد أن تأثير كل من الكينتين والبنزيل أدنين متساويين يستعملان بتركيزات من 1 – 10 جزء فى المليون ويعتقد ً أن مركب 2 ip أفضلهم فى تأثيره . أما عن حمض الجبرلين فإنه له دور أيضاً فى نمو الأعضاء وتخليقها وقد أشار Gautheret 1969 أن الجبرلين يمكن أن يكون بديل للضوء أو يعوض الاحتياجات الضوئية فى تنشيطها لتخليق الجذور فى نبات الطرطوفة وعادة يمكن استعماله فى المرحلة الثالثة StageШ للإسراع من عملية تكوين الأعضاء قبل نقلها للتربة كما يستعمل الجبرلين لزيادة نمو الأجنة الخضرية



  مبين بالاتي أهم الهرمونات النباتية وووزنها الجزيئ المستخدمة فى زراعة الأنسجة
الرمز
الهرمون
الوزن الجزيئ
الاوكسينات Auxins

pCAA
P chlorophenoxy acetic acid
186.59

2,4-D
2,4- dichlorophenoxy acetic acid
221.04

IAA
Indole- 3- acetic acid
175.18

IBA
3 – indole butyric acid
203.23

NAA
@ naphthalene acetic acid
186.20

NOA
& naphthoxy acetic acid
202.20
السيتوكينينات Purines / Cytokinins

Ad
adenine
189.13

AdSO4
adenine sulphate
404.37

BA or BAP
6- benzyl adenine or 6- benzyl amino purine
225.20

2 IP
6- dimethyl allyl amino purine or

N- isopentenyl amino purine
203.30

Kin
6- furfuryl amino purine
215.21

SD8339
6- (benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)H- purine
309.40

Ze
6(4-hydroxy-3-methlbut-2-enyl amino purine
219.20
الجبرلينات Gibberellins

GA3
Gibberellic acid
346.37
المركبات الاخرى Other compounds

ABA
Abscissic acid
264.31


colchicine
399.43

PG
phloroglucinol
126.11

الأحد، 12 سبتمبر، 2010

احدث الطرق لاكثار النباتات ( زراعة الانسجة النباتية ) - الجزء الاول


زراعة الانسجة النباتية 
plant tissue culture


 1- مصطلحات زراعة الأنسجة 
 Plant tissue culture terminology

Adventitious
: هى أعضاء نباتية ( براعم ، نموات خضرية ، جذور ...إلخ ) نتجت بطريقة عرضية فى موضع غير تقليدى أو فى وقت غير تقليدى مثل تكون النموات الخضرية على نسيج الكلس أو تكون الأجنة العرضية من الكلس بدون مبيض أو عمليات تزاوج وإخصاب.

Aseptic : هو الخلو من الكائنات الممرضة والتلوث بالفطريات والبكتيريا والفيرس ...إلخ أى خلو البيئة الغذائية من الكائنات الدقيقة وهو متطلب هام أساسى لمزارع الأنسجة النباتية.

Axillary bud : برعم أو فرع خضرى إبطى يخرج من إباط الأوراق وهو عادة يتكون من الخلايا المرستيمية الإبطه للقمم النامية وعادة تدفع لإنتاج أعداد كبيرة Mass production ويتم ذلك خلال استخدام الهرمونات التى تعمل على تثبيط السيادة القمية للقمة النامية وتشجيع إنتاج Lateral shoot .

Bud : هو البرعم الخضرى أو الزهرى وهو مازال فى حالة نشأة ولم ينمو بعد Unemerged وعادة ما يكون مغلق بعدة أوراق حرشفية تسمى Bud scale .

Calluses, Calli, Callus : هى أنسجة الجروح التى تتكون عند السطح المجروحة فى النبات وهى أنسجة غير متميزة Disorganized tumor-like masses وهى أنسجة برانشيمية تختلف فى درجة تلجننها وعادة لا يوجد بينها مادة لاحمة الميدلاميلا .

Cybrid : هى الخلية أو النبات الناتج من التهجين السيتوبلازمى مع نواة إحدى الخلايا وعضوات الخلية السيتوبلازمية من أخرى .

Differentiation : التميز أو التخلق أو هى التغيرات الفسيولوجية الحادثة فى خلايا الأنسجة أو الأعضاء أثناء التطور والنمو لتصبح الخلايا أو الأنسجة متخصصة ولها دور فسيولوجى وعمل معين .

Organogenenesis : هى نشأة الأعضاء على سطح المنفصل النباتى أو من الكلس الناتج من زراعته وهى عادة تكون إما نموات خضرية أو جذور .

Disease – free, Pathogen – free, Virus – free, Pathogen – tested : هى النباتات الخالية من أى أعراض مرضية واختبرت فى احتواءها على المسبات المرضية فكانت النتائج سلبية وتستخدم مثل تلك النباتات كمصدر للحصول على نباتات ذات مواصفات مثالية .

Embryoid or Somatic embryo : الأجنة العرضية وهى تشبه مورفولوجياً الزيجوتية وهو ينشأ من أنسجة خضرية تنتج In vitro .

Embryogenesis : هى عملية تكوين الأجنة بطريقة غير جنسية وعادة تنمو الأجنة اللاجنسية مباشرة من زراعةExplant أو بطريقة غير مباشرة من الكلس وفى بعض الحالات العرضية من الخلايا المنفردة .

Excise : هو عزل أو فصل أنسجة أو أعضاء أو قطاعات الأنسجة من النبات كأجزاء نباتية للزراعة بطريقة جراحية مثل عزل القمة النامية تحت الميكروسكوب وزراعتها In vitro .

In vitro : (هى كلمة لاتينية تعنىIn glass ) وتعنى التجارب العملية على الأعضاء النباتية والتى فى الأوعية الزجاجية Glassware والتى تنمو تحت ظروف صناعية Artificial Conditions لزراعة الأنسجة .

In vivo : (وهى كلمة لاتينية تعنى In life ) وهى التجارب العملية على الأعضاء النباتية تحت الظروف الطبيعية وهى مرتبطة بأجزاء النبات الأخرى الحية .

Induction : وهى الحث أو التغيرات الفسيولوجية التى تعمل على حدوث ظاهرة فسيولوجية أثناء عمليات التطور والتى ينتج عنه عملية Initiation .

Initiation : هو أول تغير ميكروسكوبى مرئى لتميز الخلايا وتخليقها عند تطورها إلى أعضاء .

Meristem : هى مناطق النمو والانقسام وتكوين وبناء البروتوبلاست ومنشأ الأنسجة الجديدة فى النباتات وعادة تكون الخلايا المرستيمية خلايا غير متميزة Undifferentiated منها تتكون الأنسجة المتخصصة وظيفياً أو فسيولوجية وتوجد فى القمم النامية للأفرع الخضرية أو قمم الجذور وفى أباط الأوراق وخلايا الكمبيوم الحزمى وأماكن النمو الأخرى مثل الأوراق الحديثة ...إلخ .

Meristemaid: كتلة أو خلايا عنقودية ، من خلايا مرستيمية لها القدرة على النمو والتطور تحتوى على سيتوبلازم كثيف مع عديد من الفجوات العصارية.

Shoot apex or Shoot tip : هى القمة المرستيمية الهرمية أو قبية الشكل Meristematic dome والأوراق المنبسقة Emerging leaves وبعض من خلايا الاستطالة الساقية ويجب عدم الخلط بين مصطلح Meristem tip , shoot tip فالأخير أصغر حجماً ويحتوى على القبة المرستيمية فقط أو زوج واحد من مبادئ خروج الأوراق .


Somatic Hybrid : الهجن الجسيمة وهى الناتجة من دمج الخلايا أو البروتوبلاست لتكوين Genom جديد .

Subculture : هى إعادة الزراعة من زراعة أخرى بنقل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء المتكونة على بيئة جديدة وذلك بعد مرور زمن فاصل يسمى Passage time وفى الغالب تكون البيئة الجديدة لها تركيب مختلف فى واحد أو أكثر من مكونات البيئة للحصول على شكل مورفولوجى جديد أو تطور للأعضاء وكثيراً ما يخلط البعض بين مصطلح Subculture – Reculture الأخير يستخدم فى نقل الأنسجة أو الأعضاء على بيئة غذائية طازجة لها نفس المكونات للبيئة السابقة ويكون الغرض هنا المحافظة على النسيج من التدهور نظراً لجفاف البيئة أو إنقاذ محتوياتها أو تغير درجة حموضتها أو صلاحيتها ولكن تظل الأنسجة فى نفس المرحلة من التطور .

  2- مجالات زراعة الأنسجة والخلايا

توجد أربعة مجالات رئيسية لزراعة الأنسجة والخلايا نجملها فى المجالات التالية:

1- إنتاج بعض المواد الكيماوية العلاجية والمواد الطبيعية.

2- التحسين الوراثى للمحاصيل.

3- الحصول على سلالات خالية من الأمراض.

4- استخدام زراعة الأنسجة كوسيلة سريعة للتكاثر وإنتاج غزير من النباتات.

أولاً: إنتاج المواد الكيماوية الطبية والمواد الطبيعية Production of pharmaceutical and other natural products


كما هو معروف فإن هناك عديد من النباتات التى تنتج مواد طبيعية تعتبر إحدى نواتج عمليات التمثيل الغذائى يقوم الإنسان باستخراجها واستعمالها فى صناعات عديدة أهمها صناعة الدواء وإنتاج الزيوت العطرية ومكسبات النكهة والطعم. والأمثلة على ذلك عديدة نجملها فى  التالى :

  موضح أهم المركبات الفعالة التى تستخرج من النياتات الطبية والعطرية بزراعة الأنسجة المادة
اسم النبات المستخرجة منه
1- القلويدات

- أتروبين الأتروبا Atropa belladonna

- أفيدرين Ephedra Vulgaris

- لينين Cinchona spp.

- كوكايين نبات الكولا Erythroxylon coca

-هيوسيامين السكران Hyscyamus spp.

- ستريكتين الجوز المقئ Strychnase sp.

- كافين البن Coffea Arabica

2- الجلوكسيدات

- الأميجدالين نوى الخوخ والمشمش والبرقوق .

- السالسين الصفصاف .

- زيت المستطردة نباتات الفصيلة الصليبية .

3 - الزيوت العطرية عديد من النباتات

4- الفيتامينات عديد من النباتات


ولقد أمكن استخدام زراعة الأنسجة لبعض النباتات الطبية مثل الداتورة والسكران والديجتالس لإنتاج المواد الطبية وكذلك بعض النباتات العطرية مثل الريحان والنعناع والعتر لإنتاج الزيوت العطرية وذلك بزراعة أنسجة أو أعضاء مختلفة من تلك النباتات للحصول على نسيج الكلس ثم يستخلص المادة الفعالة منه دون الحاجة لزراعة النبات بأكمله وبذلك يمكن توفير مساحات الأراضى اللازمة لزراعة هذه النباتات وكذلك توفير المجهود الزراعى وكذلك المجهود اللازم لاستخراج هذه المواد من النبات الكامل وربما يكون ذلك التكنيك من الناحية الاقتصادية أكثر نفعاً . ويعتبر هذا المجال من مجالات زراعة الأنسجة الحديثة التى لم تطرق بعد بالقدر الكافى لأنه من المتوقع أن يكون من أهم المجالات لاستخدام زراعة الأنسجة فى المستقبل القريب.


ثانياً: التحسين الوراثى للمحاصيل The genetic improvement of crops :

يخدم تكنيك زراعة الأنسجة والأعضاء والخلايا مربى النبات فى مجالات مختلفة نجمعها فى الآتى:


Embryo development-
- Embryo & Ovary culture

- Induction and isolation of mutation.

- Source of variation .
- Cell & tissue culture

- Haploid plants development
- Anther & microspore

- Mutation

- Hybridization

- Gene transfer
- Protoplasts

أن البحث عن التراكيب الوراثية أو مصادر الاختلافات الوراثية وإنتاج أصناف جديدة لهو الشغل الشاغل لمربى النبات وهو فى صدد هذا الهدف قد يواجه بعدة عقبات يمكن تزليلها بتكنيك زراعة الأنسجة والأعضاء.

1- ثبت أن الأجنة الناتجة من الهجن المتباعدة الآباء لا يتم تكوينها ونضجها مثل الأجنة الناتجة عن الهجن الجنسية والنوعية، تلك الأجنة تعانى من ظاهرة تعرف بظاهرة العقم الأندوسبيرمى Somatoplastic sterility وتنتج من عدم التوازن الكروموسومى لأنسجة الإندوسبرم والجنين فكما هو معروف أن الأجنة لا تتصل مباشرة بالأنسجة الوعائية لنبات الأم ولكن يتم الاتصال عن طريق الإندوسبرم والذى يستقبل المواد الغذائية ثم يقوم بتوصيلها للجنين عن طريق الحيل السرى . وبالفحص السيتولوجى لمثل تلك الأجنة الهجينة ثبت أن الزيجوت ينقسم عدة انقسامات أولية كالمعتاد ثم يتكون فى قاعدة البويضة أى بين الحبل السرى والطرف الكلازى منطقة بها خلايا غير حية تمنع من وصول الغذاء للأندوسبرم وعندئذ يموت نسيج الإندوسبرم والذى يعقبه موت الجنين فإذا أمكن عزل الأجنة الجنسية فى وقت مناسب وتنميتها على بيئة مناسبة فإنه يمكننا الحصول على تلك الأجنة فيما يعرف بزراعة الاجنة Embryo culture وهو هدف عظيم لمربى النبات .

2- عند سعى مربى النبات فى الحصول على قوة الهجين يواجه بعدة مشاكل أهمها طول القترة بين الأجيال والتى تطيل من برامجه فضلاً على صعوبة الحصول على نباتات متماثلة فى صفاتها الوراثية Homozyous لذلك يتطلب منه تأصيل العوامل الوراثية بالتربية الذاتية أو التهجين الذاتى لعدة أجيال فيواجه بأن نباتات الجيل الثالث أوالرابع تكون عديمة الخصوبة مما يوقف من برامجه لذلك فإن حصوله على نبات أحادى المجموعة الكروموسومية Haploid يعتبر من الآمال العظيمة لمربى النبات حيث يمكنه مضاعفتها بالكولشيسين فيحصل على نبات ثنائى المجموعة الكروموسومية وفى نفس الوقت أصيل فى عوامله الوراثية Homozygous وذلك باستخدام مجال زراعة الأنسجة بزراعة المتك أو حبة اللقاح لإنتاج نبات أحادى المجموعة الكروموسومية وفى وقت قصير جداً بالمقارنة بالطريقة التقليدية .

3- من أهم طرق التربية هو البحث عن تراكيب وراثية عن طريق الانتخاب لذلك تصعب تلك المهمة على مربى النبات إذا تضاءلت أمامه وجود مصادر الاختلافات الوراثية أما إن توافرت فيكون أمامه مهمة صعبة وهى عمل Screening لعدد كبير من النباتات وهى مهمة ولكن باستخدام تكنيك زراعة الأنسجة ومعلقات الخلايا يمكن لمربى النبات معملياً أن يتعامل مع عشيرة كبيرة جداً فى فى طبق بترى فيسهل عليه مهمة الانتخاب إذ أن الانتخاب سوف يجرى على مستوى الخلية وليس على مستوى النبات الكامل وفى هذا المجال يمكن لمربى النبات أن ينتخب لصفات عديدة مقل مقاومة الأمراض ، مقاومة الملوحة ، مقاومة سُمية المبيدات ، مقاومة النيماتودا ، مقاومة الجفاف .. الخ. ويتم ذلك بالحصول على مزارع للخلايا ثم تعامل بسموم الفطر المسبب للمرض أو بتركيزات عالية من الملح أو بتركيزات مختلفة للمبيد ثم تنتخب الخلايا التى تقاوم الصفة المرغوبة فتنتقل إلى بيئة غذائية لتكوين الكلس ثم يوجه الكلس نحو تخليق الأعضاء الخضرية والجذرية وبذلك يمكن الحصول على نبات كامل كما يمكن بنفس التكنيك استحداث الطفرات وعزلها .

4- قد يصعب على مربى النبات إجراء التهجينات الجنسية والنوعية عند الرغبة فى نقل صفة ما من نبات إلى آخر لكن عن طريق التكنيك الجديد وهو ما يعرف بتكنيك الهندسة الوراثية وزراعة البروتوبلاست يمكن إجراء تلك التهجينات فضلاً على إمكانية عزل جين بمفرده ونقله ليدمج مع المادة الوراثية لنبات مراد إدخال صفة ما فيه بالإضافة إلى إمكان نقل أى مادة وراثية معزولة من أى كائن حى إلى النبات وقد كان وذلك بالطبع مستحيل باستخدام الطرق التقليدية.

ثالثاً : الحصول على سلالات خالية من الأمراض Pathogen free plants :

تصاب كثير من النباتات بالأمراض الفيروسية ويبذل الدارسون جهداً كبيراً للحصول على نباتات خالية من الإصابة ويستخدم تكنيك زراعة الأنسجة فى الحصول على تلك النباتات بطرق عدة:

1- زراعة القمم النامية حيث وجد أن الفيرس ينتقل بصعوبة وبطء إلى قمم النباتات وبالتالى فهى غالباً ما تكون خالية من الفيرس خاصة إذ عزلت بأحجام ميكروسكوبية تصل إلى 0.2 – 0.5 ملليميتر وزراعتها للحصول منها على نبات كامل .

2- الحصول على نباتات خالية من الفيروس فقد تمكن Murashige et al 1968 من الحصول على نباتات خالية من الفيروس من نسيج النيوسلة لبعض النباتات أحادية الأجنة Monoembryonic فى الموالح (الشادوك) وفى تلك الحالة أمكن إنتاج نباتات خالية من الفيروس وفى نفس الوقت مشابهة للأم من حيث الصفات أنها أجنة جسمية.

3- استخدام التطعيم الدقيق نظراً لصعوبة الحصول على نبات كامل من زراعة القمة النامية مباشرة على بيئة غذائية فى بعض النباتات فقد استحدث هذا التكنيك Shoot tip micrografing وذلك بزراعة بذور الأصل فى الظلام ثم عزل القمة النامية بطول 0.14 – 0.18 ملليميتر وتطعيمها على بادرة الأصل وبذلك نحصل على شتلة مكونة من أصل وطعم وخالية من الفيروس بعد عدة أسابيع.

رابعاً: استخدام زراعة الأنسجة كوسيلة سريعة للتكاثر Rapid clonal multiplication

نظراً لأن طريقة التكاثر الخضرى بالوسائل التقليدية ليست سريعة بالدرجة الكافية لمواجهة الطلب المتزايد على النباتات خاصة نباتات الزينة فإن أسعار تلك النباتات فى الزيادة فى جميع بلدان العالم مما دفع الكثير إلى استخدام تكنيك زراعة الأنسجة لتوفير تلك الأعداد من النباتات بسعر مناسب فى حيز محدود. كما نجح إكثار بعض النباتات الصعبة الإكثار والغالية مثل الأوركيد بذلك التكنيك كما أمكن إنتاج أعداد كبيرة من نخيل البلح والذى يمتاز بقلة خروج الفسائل عليه وارتفاع أثمانها .

3- مراحل زراعة الأنسجة

للوصول إلى الأهداف السابقة الذكر فإن هناك ثلاثة مراحل رئيسية للحصول على زراعة ناجحة للأنسجة وهى:

أولاً: الحصول على مزرعة معقمة Stage І : Establishment of a septic culture

هذه المرحلة هامة جداً وتعتبر من أهم مراحل زراعة الأنسجة والغرض منها ببساطة هو الحصول على مزرعة معقمة بمعنى عدم تلوث البيئة الغذائية المستعملة أو الأنسجة المستخدمة فى الزراعة Explants بأى كائن دقيق يسبب تعفنها وموتها . ويأتى ذلك بتعقيم الأدوات المستعملة وتعقيم البيئة المستخدمة وكذلك تعقيم الأنسجة المستعملة والتى تكون عبارة عن أجزاء من النبات المراد إكثاره مثل القمم النامية للسيقان والجذور أو أجزاء من السيقان أو الأوراق أو نسيج الكلس ..............الخ. ثم إتمام الزراعة أيضاً فى جو وحيز معقم.

ثانياً: زيادة الأعضاء المتكاثرة Stage П : Multiplication of propagula

لهدف من تلك المرحلة هو زيادة الأعضاء والتراكيب التى تعطى فى النهاية النبات الكامل لذلك تعتمد تلك الخطوة على زيادة إنتاج الأعضاء العرضية Adventitious organs أو زيادة تكوين الأجنة أو زيادة تنشئة النموات الجانبية Axillary shoots وعندما يكون الكلس خطوة وسطية يكون الهدف فى تلك المرحلة هو زيادة نمو الكلس ثم تخليق النموات العرضية الخضرية منها أو تكوين الأجنة الجسمية Somatic embryo وفي التالي  تتبين الطرق المختلفة لزيادة Propagula فى هذه المرحلة Stage

في الاتي  أهم النباتات التى نجحت بزراعة الأنسجة ومصدر المنفصل النباتى وطرق تضاعفها

Methods of Multipication
Explant Source
Plant

Alliaceae

Callus, Adventitious bulb
Aerial bulb scale
Allium capa

Asteraceae

Callus, Adventitious shoots
Stem, Shoot tip
Chrysanthemum morifoliume

Axillary shoots
Shoot tip
Gerbera jamesonii

Adventitious shoots
Cotyledon, Hypocotyl, Root
Lactuca sativa

Bogoniaceae
Adventitious shoots
Leaf
Begonia rax

Rosaceae

Adventitious shoots
Stem
Rosa sp

Brassicaceae

Adventitious shoots
Leaf, Stem, Root
Brassica laraceae

Eubiaceae

Callus, Asexual embryo
Stem
Coffea arabica

Rutaceae

Asexual embryo
Nucleus tissue
Citrus sp

Convolvulaceae

Adventitious shoots, Callus
Stem, Root
Convolvulac arvensis

Solanaceae

Adventitious shoots, Callus
Anther
Solpiglassis sinuata

Callus, Asexual embryo
Embryo
Solpiglassis melongena

Adventitious shoots
Leaf
Solpiglassis nigrum

Adventitious shoots
Tuber
Solpiglassistuberosum

Adventitious shoots, Callus
Leaf, Stem
Nicotiana tabacum

Adventitious shoots, callus, Asexual embryo
Leaf, Root
Atropa balladona

Geraniaceae

Adventitious shoots, Callus
Stem, Shoot tip, Anther Pelargonium hortorum

Cucurbitaceae

Callus, Asexual embryo
Cotyledon, Hypocotyl
Cucurbita pepo


ثالثاً: الإعداد لنقل النبات للتربة Stage Ш : Preparation of re-establishment of plant

يمكن اعتبار أن التكاثر عن طريق زراعة الأنسجة ناجحاً إذا توج بنجاح نقل النبات الناتج فى الأنبوبة المعقمة إلى التربة واستمرار نموه وللوصول لهذه الغاية يجب العمل على أقلمة أو تقسية النباتات Hardening of plant قبل نقلها للظروف الصعبة المحتمل أن تواجهها فى التربة مثل نقص الرطوبة Stress tolerance to moisture خاصة إذا علمنا أن تلك الأنسجة تعتبرنامية فى وسط مائى Heterotrophic وسوف تنتقل إلى وسط آخر Autotrophic state . كذلك يجب استيفاء تلك النباتات لاحتياجاتها الحرارية أن وجدت لإنهاء طور الراحة كما للأبصال وللكورمات والريزومات احتياجات البرودة Chilling requirement فيجب استيفاءه قبل نقلها للتربة .

احتياجات كل مرحلة Requirements of each stage :

إحتياجات كل مرحلة تشمل احتياجات غذائية بمكونات البيئة وطبيعتها واحتياجات بيئية أى تعرض الأنسجة لدرجات حرارة وشدة إضاءة معينة. وعند دراسة المرحلة الأولى يجب ألا نغفل أن نجاح التكنيك يعتمد أساساً على حسن اختيار الجزء المنزرع Explants أما المرحلة الثانية فإن نجاحنا يتحدد بمعرفتنا إلى طريقة زيادة الأعضاء العرضية المتكونة مثل النموات العرضية والأجنة الخضرية والنموات الجانبية ..الخ. أما فى المرحلة الثالثة فيجب أن نكون ملمين بالاحتياجات الفسيولوجية للنبات المتكون كاحتياجه مثلاً لكسر طور سكونه إن كان له طور سكون أو احتياجه إلى معاملات خاصة للتقسية مثل تعريضه إلى إضاءة ذات شدة عالية High intensity light .

وفى الاتي سوف نسوق ثلاث أمثلة لنباتات Bromeliads, Gerbera, Asparagus لتوضيح احتياجات كل مرحلة من الهرمونات والاحتياجات البيئية وكذلك طبيعة البيئة الغذائية لكل لنبات .

في الاتي موضح أهم الاحتياجات المصاحبة لكل مرحلة من مراحل زراعة الأنسجة لثلاثة من النباتات

Characteristic
Asparagus
Gerbera
Bromelaids

Stage І

- - Explant
O.15mm shoot tip
2- 3mm shoot tip
Lateral bud

- Medium
Agar, Ms salts + O.3mg NAA+O.1 Kinetin
Agar, Ms salts 0.5IAA+ 10 Kinetin
Liquid, 1 rpm

1.75IBA+1.75NAA+

150mg/L citric acid

- culture environment
27c, 16 hr daily 1000LUX
27c, 16 hr, l000LUX
27c 16 hr, LUX

Stage П

- Method of Multiplication
Axillary shoot,

adventitious root
Axillary shoot
Adventitious shoot

- Medium
None change
None change
Liquid MS, 2 IAA+2K 80mg/L adenine sulfate 170mg/LNaH2PO4H2O

- Culture Environment
None change
None change
None change

Stage Ш

- Medium
Remove NAA
Remove Kinetin increase IAA to l0mg/L
Remove K, Adenine sulfate, NaH2 PO4. H2O

- Culture Environment
Increase light to 10,000 LUX
Increase light to10,000 LUX
Increase light 3000 LUX

الخميس، 9 سبتمبر، 2010

(طرق الاكثار ) لكل من يحب رعاية النباتات و اكثارها ( الجزء الخامس)



4-  الخلفات(الفسائل( :

تعتبر الخلفة نمواً جانبياً قصيراً يخرج من النبات الأصلي قريباً من سطح التربة وله جذور مستقلة بذاته، ويمكن فصل هذه الخلفة من النبات الأم وزراعتها . وذلك كما في نخيل التمر ونخيل الزينة والموز. ويجب عند فصل الخلفات (الفسائل) عن الأمهات مراعاة ما يأتي :
أ _ تجنب كثرة الجروح أثناء فصل الخلفات لأنها تزيد من إحتمال إصابة الخلفات بالأمراض وتستخدم عادة آلة حادة مثل العتلة الحديدية تفصل فيها الخلفات بحيث يكون سطح الإنفصال أو القطع مستوياً ونظيفاً وأملساً.
ب_ يراعى عند فصل الخلفة أن يكون لها مجموع جذري حيث تقل نسبة نجاح الفسائل عديمة الجذور .
ج- أن تكون الفسائل خالية من الأمراض وأن تكون منقولة من أرض جافة ورملية.
د- أن تكون الفسائل ذات محتوى غذائي جيد ولون الجريد أخضر وأن لا تكون مقلمة تقليماً جائراً مع حدوث توازن بين المجموع الخضري والمجموع الجذري 

5- السرطانات:

السرطانات عبارة عن نموات تخرج من براعم ساكنة بالقرب من قاعدة النبات أو تحت سطح التربة تعتمد في غذائها على الأم حيث لا يكون لها جذور مستقلة بنفسها. وبذلك تختلف عن الخلفات (الفسائل) والتي يكون لها جذوراً مستقلة بذاتها. ويراعى عند فصل السرطانات عن الأم أن تفصل بجزء من الجذع الأصلي يطلق عليه الكعب وذلك ليساعد على تكوين جذور للنبات الجديد بما يحتويه من مواد غذائية. ومن النباتات التي تتكاثر بهذه الطريقة الحور ورمان الزهور والبلمباجو 


6- التكاثر عن طريق بعض الأجزاء النباتية النامية تحت سطح التربة:

تتميز بعض النباتات خاصة أبصال الزينة المزهرة وبعض محاصيل الخضر وبعض النباتات الطبية والعطرية بنمو بعض أعضائها لأداء وظيفة تخزينية للغذاء أو المواد الطبية والعطرية، وتنمو تحت سطح التربة ولها المقدرة على إعادة دورة حياة النبات عن طريق هذه الأجزاء الأرضية التي تتميز بوجود البراعم الخضرية وهذه تشمل:

أ_ الأبصال الحقيقية:

البصلة عبارة عن ساق قرصية أرضية قصيرة ، تحمل برعماً طرفياً كبيراً وتحيط به قواعد الأوراق اللحمية العصارية المملوء بغذاء مدخر . وعندما تزرع البصلة في الموعد المناسب في التربة تنمو جذور عرضية ليفية من قاعدة الساق القرصية القصيرة ، ثم ينشط البرعم وينمو ويشق طريقة إلى أعلى فوق سطح التربة .ومن أهم الأبصال المزهرة التيوليب والنرجس ، الأمريللس والليلم ، ومن الخضر بصل الطعام 

ب_ الكورمات:

الكورمة عبارة عن ساق منتفخة ومختزنه للمواد الغذائية ، ومقسمة إلى عدة عقد وسلاميات ويشاهد على الكورمة أوراق حرشفية يوجد في آباطها براعم . وتحمل الكورمة عند قاعدتها جذور عرضية يمتص الماء والأملاح وقد تنمو البراعم الجانبية وتكون ساقاً منتفخة ومختزنة للغذاء يسمى بالفك. ومن أهم الأنواع التي تتكاثر بالكورمات الجلاديولاس والفريزيا والزنبق ومن محاصيل الخضر القلقاس .

ج_ الدرنات والجذور المتدرنة:

الدرنات عبارة عن سيقان أرضية متحوره لأجل إختزان الغذاء . يوجد على سطح الدرنة مواضع غائرة تسمى (عيون) وكل عين تحتوي على بضع براعم . وعندما ينمو البرعم يرسل ساقاً هوائية مورقة إلى أعلى ومن قاعدة هذه الساق تخرج جذور عرضية تنتشر في التربة كما تخرج سيقاناً أرضية تحمل الدرنات الجديدة ومن أهمها البطاطس (نباتات الخضر) والبيجونيا (نباتات زينة). وكما توجد لبعض النباتات جذور متدرنة ومتحورة تخزن فيها المواد النشوية ومن أهمها البطاطا الحلوة ( نباتات الخضر ) والأنيمون والداليا ( نباتات الزينة).

د- الريزومات:

عبارة عن سيقان مدادة أو زاحفة تنمو تحت سطح التربة ومقسمة إلى عقد وسلاميات وتوجد براعم عند العقد مغطاة بأوراق حرشفية أو عصيرية، وعند الإكثار بالريزومات فإنها تنقسم إلى أجزاء يحتوي كل منها على عقدتين (برعميين على الأقل) وتزرع أفقية على العمق المناسب. ومن أهم النباتات التي تتكاثر بالريزومات نبات الكلا والكنا وعصفور الجنة والسوسن (الأيرس النجيلي) والنعناع الفلفلي والهيل والزنجبيل والنجيل البلدي .

7- التفصيص:

وهي تجري لبعض النباتات العشبية المعمرة ولها سيقان تاجية قزمية وتنمو مفترشة تحت سطح التربة. ولذا فإن عدد من البراعم المتواجدة عليها تنشط وتتكشف عنها نباتات صغيرة يتكون لكل منها مجموعاً جذرياً إلا أنها لا تزال متصلة بالنبات الأم وهذه النباتات تزاحم النبات الأم وتضعف من نموه ولذا فأنه يمكن فصلها وتفصيصها عن بعضها كنباتات كاملة الهيئة من جذور وسيقان وأوراق وتزرع منفردة في أصص صغيرة. ويتكاثر بهذه الطريقة البنفسج المصري والفلانجيم والأسبرجس والفراولة والخرشوف وغيرها.

8- بالتقسيم أو تجزئة النبات:

ويقصد به تقطيع الأجزاء النباتية المتحورة خاصة السيقان والجذور والتي تنمو تحت سطح التربة والتي لها القدرة إذا قسمت إلى أجزاء أن يعيد كل جزء منها دورة حياة النبات كاملة. وغالباً ما يتم التقسيم بالنسبة للرايزومات والدرنات ، وهي أعضاء تخزينية لا تحتوي على أوراق بل تحتوي على البراعم الخضرية التي تنشط ويتكشف عنها نباتات جديدة . ويتكاثر بهذه الطريقة بعض نباتات الزينة وأبصالها مثل الكنا والكلا والأوركيد . كذلك من الخضر تقسم درنات البطاطس

الأربعاء، 8 سبتمبر، 2010

(طرق الاكثار ) لكل من يحب رعاية النباتات و اكثارها ( الجزء الرابع)


3- الترقيد :
يقصد به ثني فرع نامي أو فرخ من النبات الأم إلى الأرض ودفنه وهو مازال متصلاً بها وبذلك يستمر هذا الفرع في نموه معتمداً تماماً على النبات الأم فيما يحصل عليه من غذاء. ومن ثم يفصل هذا الفرع بعد تكوين الجذور عليه ليكون نباتاً مستقلاً. ويجرى عادة في أوائل فصل الربيع.
أنواع الترقيد هي:
أ- الترقيد البسيط.
ب- الترقيد المركب أو الثعباني.
ج- الترقيد الخندقي أو الطولي.
د- الترقيد التاجي.
هـ - الترقيد الهوائي
و- الترقيد الطرفي أو القمي.

أ – الترقيد الأرضي البسيط :
وفي هذه الطريقة يتم إكثار النباتات ذات الأفرع الأسطوانية المرنة القاعدية . وفيها يختار أحد الأفرع القريبة من سطح التربة ويثنى ثم يدفن هذا الجزء الذي تم ثنيه تحت سطح التربة وعلى عمق يتراوح من 10-20 سم يبقي طرف الفرع المرقد خارجاً فوق سطح التربة . ويمكن تشجيع خروج الجذور العرضية على الفرع المرقد في منطقة الدفن ، وذلك بعمل مجموعة خدوش على العقد أسفل البراعم الموجودة في المنطقة المدفونة من الفرع . وعند التأكد من تمام تجذير الفرع المرقد يفصل عن النبات الأم ثم يزرع منفصلاً في المشتل أو في الأرض المستديمة مباشرة ، وهذا هو الغالب . ويتكاثر بهذه الطريقة العنب والياسمين الأبيض والزفر وست الحسن وشبر فايد والارجيريا وغيرها .
 
 










ب- الثعباني أو المتكرر :
وهو يشبه الترقيد الأرضي البسيط ألا أنه في هذه الطريقة يختار الأفرع الطويلة المرنة حيث يثنى الفرع لأكثر من مرة وتدفن الأجزاء التي تم ثنيها تحت سطح التربة بحيث تبدو منطقة من الفرع مدفونة تحت سطح التربة تليها منطقة أخرى ظاهرة فوق سطح التربة من الفرع ويكرر ذلك عدة مرات ، إلى أن نصل لنهاية الفرع بما فيها البرعم الطرفي له تبقي خارج أو فوق سطح التربة . ويتم تثبيت كل منطقة تم دفنها من الفرع باستخدام الأسلاك كما في حالة الترقيد البسيط . ويتكاثر بهذه الطريقة الهيدرا – العنب – الايبوما والياسمين بأنواعه 


ج – الترقيد الطولي ( الفرنسي (:
وفي هذه الطريقة يعمل خندق على شكل متوازي مستطيلات عمقه 5-15سم وبطول الفرع . ثم يدفن الفرع كاملاً بما في ذلك طرف الفرع بالخندق ويغطي بالتربة ويثبت في هذا الوضع . ويتم عمل خدوش عند كل عقدة على إمتداد الفرع المرقد وهى المناطق التي سيتم خروج الجذور العرضية عندها . ويوالي ري الفرع حتى يبدأ ظهور النموات الخضرية على إمتداده . وهذه النموات المتكثفة يكوم حول قاعدة كل منها طبقة من الطمي تزداد كلما إرتفعت هذه النموات لأعلى لتشجيع تكوين الجذور على قواعد هذه الأفرع الخضرية . وتفصل هذه النموات فرادى لكل منها مجموعة الجذري المستقل في الربيع التالي حيث تزرع بأرض المشتل على خطوط لعام آخر تم تنقل للأرض المستديمة بعد ذلك . وفي هذه الطريقة نحصل على عدد كبير من النباتات . ويتكاثر بهذه الطريقة الياسمين الزفر وغيرها 


د – الترقيد التاجي :
وتتبع هذه الطريقة في حالة الأشجار أو الشجيرات ذات الأفرع الجانبية الصلبة والتي يصعب ثنيها وفي نفس الوقت البعيدة عن سطح التربة . ولعمل الإكثار بالترقيد التاجى تقلم النباتات المراد إكثارها تقليماً جائراً إلى قرب سطح التربة وذلك عند بدء موسم النمو في الربيع أو آخر الشتاء . تؤدى هذه المعاملة إلى تنشيط وحفر البراعم الجانبية القاعدية الموجودة على جذع الشجرة أو الشجيرة وفي منطقة التاج . فتنمو هذه البراعم منتجة أفرعا خضرية . ثم يكوم حول قواعد هذه الأفرع بالتربة التي يداوم على ترطيبها لتشجيع خروج الجذور العرضية عند قواعدها .تكرر عملية الترديم أو التكويم هذه حتى يصل إرتفاع التربة حول قواعد الأفرع إلى 30سم . عندما يحل فصل النمو التالي يمكن فصل هذه الأفرع وزراعتها بأرض المشتل لعام آخر أو قد تزرع في إماكنها المستديمة مباشرة وهذا هو الغالب . وهذه الطريقة شائعة الاستخدام في إكثار المانجو والورد واللانتانا واللجسترم وغيرها 

هـ - الترقيد الهوائي :
ويستعمل فيها أنواع خاصة من الأقماع وقد تستعمل أكياس بولي ايثيلين . تملأ بالمواد الدبالية أو طحالب أو تربة مع سماد بلدي ثم تطبق علي أحد أفرع النبات بحيث يكون محلقا ويوالي بالترطيب فينمو علي الجزء المغطي جذور . تقطع هذه الترقيده بعد ذلك وتزرع كنبات مستقل ويستعمل بكثرة في الوستريا والهبسكس الكروتن والدراسينا والفيكس.
وعموما فعيب الترقيد أن عدد النباتات الناتجة منه محدودة . لكن ميزته أنه يمكننا من إكثار أصناف يصعب جدا إكثارها بالعقل كالتفاح كذلك فإن النجاح فيه مضمون لاتصال الترقيدة بالأم فلا تجف أو تتعفن 


و – الترقيد القمي :
تتلخص هذه الطريقة في عمل خندق صغير ، ثم أثناء فصل الصيف ترقد ( تغطي ) القمة النامية للفرع القريب من سطح التربة ولعمق يتراوح من 10-20سم أو قد يتم هذا في الأصص عوضاً عن التربة خاصة إذا ما كان الفرع مرتفعاً بالقدر الذي لا يسمح بوصوله إلى سطح التربة . وبعد أسابيع قلائل تتكون الجذور العرضية . ويمكن فصل النبات الناجح التجذير وزراعته في أرض المشتل في الخريف التالي مباشرة

 العوامل التى تؤثر على نجاح التكاثر بالترقيد:
 يمكن تشجيع تكوين الجذور بمعاملة الترقيدات بإحدى الطرق التى تمنع أو تعوق انتقال المواد العضوية (المواد الكربوهيدراتية والهرمونات وعوامل النمو الأخرى) من قمة الفرخ النامى إلى قاعدته مثل التحليق، وبذلك تتجمع هذه المواد العضوية فى جزء الفرع المرقد مما يشجع تكوين الجذور عليه بالرغم من أن الفرع لازال متصلاً بالنبات الأم. ولا يتأثر نجاح الترقيد بالوقت اللازم لتكوين الجذور وذلك لأن الترقيدات تبقى متصلة بالأم إلى أن يتم تكوين الجذور عليها دون أن تجف أو تتعفن. ويستعمل التظليل Etiolation  لتشجيع تكوين الجذور فى الترقيد. وينتج عن التظليل تغير فى الحالة الداخلية للأفرخ النامية تناسب تكوين الجذور. ويجرى ذلك فى الترقيد التاجى والترقيد الخندقى بتغطية قواعد الأفرخ الجديدة النامية بالتربة باستمرار كلما نمت بحيث يبقى الجزء القاعدى من هذه الأفرخ غير مغرض للضوء وهذا يفسر إلى حد كبير السبب فى نجاح تكوين الجذور فى الترقيد الخندقى والترقيد التاجى فى النباتات التى يصعب فيها تكوين الجذور.

وتستعمل المواد المنظمة للنمو كذلك فى تشجيع تكوين الجذور فى الترقيد. ويمكن استعمال هذه المواد بنجاح أو بطريقة فعالة على هيئة مسحوق أو فى عجينة اللانولين أو على هيئة محلول فى كحول 50%، ويتوقف تكوين الجذور فى الترقيد على توفر الرطوبة المناسبة والحرارة المناسبة فى منطقة تكوين الجذور، ولوحظ أن جفاف التربة لفترة طويلة وكذلك التربة الثقيلة المتماسكة يعوق نمو الجذور خصوصاً فى الأطوال الأولى لتكوينها. ولذلك فإنه فى الترقيد التاجى للسفرجل والتفاح وجد أن إضافة البيت موس الحبيبى الى التربة حول قواعد الأفرخ النامية يشجع كثيراً تكوين الجذور.
 ولوحظ كذلك أن الحرارة العالية أكثر من اللازم فى الطبقات العلوية من التربة أثناء الربيع والصيف قد تؤدى إلى جفاف التربة وزيادة تماسكها وهذا يمنع تكوين الجذور ويضر الأفرخ النامية كذلك.
 مميزات الترقيد واستعمالاته
   تنحصر مميزات الترقيد واستعمالاته فى الآتى:
1-  يمتاز الترقيد بضمان نجاح تكوين الجذور وذلك لأن الفرع المرقد قد يظل متصلاً بالنبات الأم إلى أن يتم تكوين الجذور التى يعتمد عليها الفرخ المرقد فى غذائه.
2-  يستعمل الترقيد فى إكثار النباتات التى يصعب إكثارها بالعقل أو بالتطعيم أو بغيرها من طرق التكاثر الخضرى مثل أصول البرقوق الميروبلان وبعض أنواع العنب.
3-  يمكن إجراء الترقيد بسهولة، كذلك لا يحتاج إلى عناية خاصة من حيث التربة المناسبة والرى والحرارة كما هو الحال فى التكاثر بالعقلة.
4-  لا يحتاج الترقيد إلى مهارة أو فن فى إجرائه كما هو الحال فى التطعيم.
5-  يحتاج التكاثر بالترقيد إلى وقت قصير نسبياً إذا قورن بالتكاثر بالعقلة أو بغيرها من طرق التكاثر الخضرى.
6-  يستعمل الترقيد فى ترقيع الجور الغائبة كما فى العنب إذ يمكن ترقيد قصبة طويلة من الكرمة المجاورة مكان الكرمة الغائبة.