اساسيات الزراعة بالانسجة
5 - أساسيات الزراعة بالأنسجةأولاً: العمل فى جو معقم Aspect work
تشتمل زراعة الأنسجة على عزل وزراعة خلايا منفردة أو أنسجة أو أعضاء نباتية من أجزاء النبات وزراعتها على بيئة غذائية سائلة أو شبه صلبة تحتوى على مكونات متكاملة حيث تشمل مصدر للكربون فى صورة السكريات مثل السكروز ومصدر للعناصر الكبرى والصغرى مثل النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم والكالسيوم والماغنسيوم والكبريت والحديد والمنجنيز والنيكل والكوبلت والزنك والنحاس والبورون والمولبيدنيم. كذلك تحتوى البيئة الغذائية على الفيتامينات والهرمونات بتركيزات متوازنة مما جعل البيئة الغذائية وسط ملائم لعديد من الفطريات والبكتريا التى تنتشر فى الجو والتى يمكن لها أن تتطفل على تلك البيئة الغذائية الغنية مما يؤدى إلى تلوثها لذلك كان من الواجب أن يتم تعقيم البيئة قبل استخدامها فى الزراعة وتعقيم الأدوات المستعملة وكذلك تعقيم الأنسجة " المنفصل النباتى " Explant المنزرعة فضلاً على اتمام الزراعة فى جو خالى من الكائنات الدقيقة التى تؤدى إلى تلوث تلك الزراعات وذلك بإتمام العمل داخل غرفة معقمة أو كابينة معقمة Clean Environment .
ثانياً: التحكم فى الجو البيئى Environment Control
بعد إتمام عملية عزل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء النباتية وزراعتها على البيئة الغذائية المناسبة يجب أن تحضن فى جو ملائم تتوفر فيه نسبة الرطوبة الملائمة ودرجة الحرارة وشدة الإضاءة المناسبة لذلك يجب توفر غرفة تحضين أو حضانة يمكن التحكم فى درجة حرارتها وشدة إضاءتها. كذلك يجب أن تشتمل على أرفف لوضع حوامل الأنابيب أو الدوارق وتعرض تلك الأرفف إلى إضاءة مناسبة حسب مرحلة الزراعة وتزود وحدة الإضاءة بميقاتى للتحكم فى طول فترات الإضاءة .
ثالثاً: الإمكانيات المعملية Laboratory Facilities
1- استعدادات النظافة Provision of clean
يجب أن يكون هناك إمكانيات عالية لنظافة معمل زراعة الأنسجة ومداومة ذلك بشكل روتينى يومى حتى يتحقق النجاح باستمرار فى استخدام هذا التكنيك بكفاءة عالية، ويتم ذلك بشفط الأتربة ميكانيكياً ومسح وترطيب الأرضيات وتنظيف المناضد والنوافذ والحضانات والثلاجات تنظيفاً جيداً. كذلك يجب غلق الأبواب غلقاً محكماً. كذلك يجب أن تكون الجدران والأرضيات والأسطح جميعها ناعمة الملمس سهلة التنظيف ويفضل أن تصنع أسطح المناضد Bench Surface من مادة الفورميكا Formica .
2- عمليات الغسيل Washing up
يجب أن تتم عمليات غسيل الأدوات والزجاجيات والدوارق والأنابيب غسلاً جيداً باستعمال الماء الدافئ لذلك يجب أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على مصدر للماء الدافئ فضلاً على ماء مقطر وذلك لشطف الزجاجيات به ولاستعماله فى تحضير البيئات. ويفضل الماء المقطر مرتين والمعروف باسم Double distilled water كذلك يفضل استخدام الماء الخالى من الأملاح خاصة الصغرى منها لسميتها للأنسجة الرهيفة المزروعة مثل النحاس لذلك يستعمل الماء المعاد تقطيره والمعروفة De-ionizer وفى حالة عدم توافر تلك الإمكانيات يمكن أن يمرر الماء المقطر مرتين على مرشح ايونى Ion exchange لفصل الأملاح المتأينة على الرزين وبذلك نحصل على ماء مقطر لثلاث مرات Triple distilled water وعند الرغبة فى تخزين الماء المقطر يجب أن يكون ذلك فى آنية مغطاة زجاجية أو بلاستيكية محكمة ويفضل عدم استعمال الماء المخزون لفترة طويلة حتى لا يكون قد تلوث بالطحالب والفطريات ويجب غسيل آنية الماء دورياً The containers should be cleaned regularly . ولعمليات الغسيل يجب أن يتوفر لها صوانى بلاستيكية Plastic bowls or plastic bucket وذلك لنقع الأنابيب والزجاجيات والأطباق البترى فيها فترة قبل الغسيل بالفرشاة . وبعد الغسيل تشطف عدة مرات بالماء المقطر وتترك عندئذ لتصفية الماء على الحوامل ثم تجفف بعد ذلك فى الفرن قبل تخزينها فى دولاب الزجاجيات لحمايتها من الأتربة.
ويفضل أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على ماكينة أتوماتيكية للغسيل Automatic washing machine لإجراء عمليات الغسيل الدورى ولتسهيل العمل ويجب الأخذ فى الاعتبار أن الغسيل اليدوى يفضل فى بعض الحالات . ويجب التخلص من النفايات والزجاج المكسور والبيئات الملوثة بعد تعقيمها بالأتوكلاف وذلك باستعمال أكياس من البلاستيك ذات الحافة المغلقة لكى تغلق باستمرار وتستبدل يومياً لتقليل التلوث بالمعمل والمحافظة على نظافته.
3- إعداد البيئة وتخزينها Media preparation and storage
تحضر البيئة الغذائية كما سبق الذكر من الأملاح المعدنية والفيتامينات والهرمونات والسكر بالإضافة إلى الأجار وعادة تحضر البيئة فى صورة Stocks عالى التركيز من كل من الأملاح والفيتامينات والهرمونات . وذلك يرفع تركيز تلك المواد إلى عشرة أضعاف × 10 أو مائة × 100 وتخزن تلك الـStocks فى زجاجات داكنة اللون أو فى قنينات زجاجية أو بلاستيكية Glass plastic vials وذلك داخل أماكن باردة وتشمل ثلاجة كهربائية، أو مبرد تحت الصفر (- 20 °م) Deep freezer أو تخزن فى مجفف Desecrator أو فى غرفة مبردة تحتوى على أرفف لتخزين البيئات الجاهزة أو الـ Stocks . ولتجهيز تلك البيئات يجب استعمال موازين دقيقة حساسة لوزن مكونات البيئة الدقيقة كذلك يجب استعمال مقلب مغتاطيسى Magnetic hot plate stirrer لتقليب الأملاح والفيتامينات والهرمونات أثناء إذابتها .
4- قياس الرقم الهيدروجينى Determination of PH
كثير من العمليات الفسيولوجية تؤدى إلى تغير الرقم الهيدروجينى داخل الخلية وهذا التغير يؤثر فى تلك العمليات ولهذا فإن فهم الرقم الهيدروجينى PH يعتبر مهماً فى مجال زراعة الأنسجة ومن المهم أن يكون واضحاً أن ذلك التغير يجب أن يكون طفيفاً لكى لا تتأثر الخلايا و تفقد مقدرتها على الاستمرار فى فعاليتها ونشاطها.
والرقم الهيدروجينى هو مقياس لتركيز أيون الهيدروجين فى محلول ما يعرف بأنه اللوغاريتم السالب للأساس عشرة لفاعلية ذلك الأيون –Log 10 والرقم الهيدروجينى لسيتوبلازم الخلايا يختلف من 6:6.5 أما عن الفجوات العصارية فهى ذات رقم هيدروجينى حمضى إذ يبلغ 1.5 : 2 فى أوراق البيجونيا فى حين أنه 5.5 فى أوراق الليمون. ولكن الرقم الهيدروجينى للخلايا البرنشيمية فى الجذور والسيقان 5.5 : 6 ويرجع ميل تركيزات أيون الأيدروجين ناحية الحموضة داخل الخلايا النباتية إلى احتوائها على الأحماض العضوية Organic acids والتى تختلف فى درجة تفككها وكذلك فى احتوائها على المجموعات الكربوكسيلية التى تتفكك , فحمض الماليك مثلاً يحتوى على مجموعتين بينما حمض الستريك يحتوى على ثلاث مجموعات . فالرقم الأيدورجينى للسيتوبلازم كما نرى غير منخفض ويرجع ذلك إلى إحتواء الخلية على القواعد والمجموعات التى يمكن أن تتحد بالبروتينات المتفككة من تلك الأحماض مثل البيكربونات والفوسفات ومجموعات أمينية ولو أن الأخير لا يعد قاعدة قوية لذا فإن المجموعات السابقة تعمل على الإتحاد بالبروتينات المتفككة من الأحماض العضوية وبالتالى فهى تعمل كنواتج Buffers فسيولوجية لزيادة الرقم الهيدروجينى فى سيتوبلازم الخلية وبهذه الميكانيكية تعمل الخلايا على المحافظة على رقم هيدروجينى ثابت .
لذا يجب ضبط PH البيئة الغذايئة عند درجة تركيز هيدروجينى مناسب يلائم امتصاص تلك الخلايا للمواد الغذائية واستمرار نموها ونشاطها على تلك البيئة حيث أن زراعة النسيج على بيئة ذات PH منخفض فى أى من الجهتين فإن ذلك يؤدى إلى انخفاض درجة تشبع الأنزيمات بالمواد المتفاعلة Substrate وقد تفقد الأنزيمات نشاطها نتيجة تغير حالة التأين للمراكز النشطة بالأنزيمات وبالطبع فإن فقد الأنزيمات لنشاطها تفقد الخلايا نشاطها أيضاً . لذلك يجب استخدام جهاز جيد لضبط الرقم الهيدروجينى ومعايرته من آن لآخر باستخدام Buffer solution حديث التحضير ، ويعتمد جهاز PH meter على اختلاف فرق الجهد الكهربى بين المناطق المختلفة فى نشاط أيوناتها المشحونة حيث يغمر إلكترود الجهاز فى محلول البيئة لقياس PH ويعدل ذلك الرقم بإضافة عدة نقط من حامض أو قلوى معلوم العيارية .
5- التعقيم Sterilization
تعقم عادة الأدوات والزجاجيات التى تستخدم فى الزراعة مثل الأطباق البترى والكئوس والماصات ورقائق الألمونيوم والشاش..إلخ وتعقم الزجاجيات داخل الفرن على درجة حرارة 160 – 180 م لمدة 1.5 : 2 ساعة مع تغليفها بورق الألومنيوم ثم بعد التعقيم تنقل إلى غرفة أو كابينة الزراعة ، أما البيئات الغذائية فعادة تعقم داخل الأتوكلاف على درجة 121 م لمدة 15 دقيقة و الأتوكلاف جهاز للتعقيم يحتوى على إناء من الصلب يتحمل الضغط وتعتمد فكرة التعقيم وعليه ترتفع معها درجة غليان المحلول وبذلك لا تغلى المحاليل داخل الأتوكلاف حيث يصاحب ارتفاع الضغط ارتفاع مصاحب فى درجة الغليان ودرجة الحرارة 121 م عند 1.2 ضغط جوى وهى درجة كافية لقتل الكائنات الدقيقة، ويترك الجهاز دون فتح البخار حتى ينخفض الضغط داخله ليتعادل مع الضغط الجوى وإلا تطايرت أغطية الأنابيب وأدت درجة الحرارة العالية إلى غليان محاليل البيئة .
تعقم بعض المواد التى يمكن أن تتأثر بحرارة الأتوكلاف مثل حمض الجبرلين والأنزيمات المستخدمة فى تحليل جدر الخلايا عند زراعة البروتوبلاست باستخدام فلتر خاص لا يسمح بمرور الكائنات الدقيقة وتستقبل المادة المعقمة داخل أنابيب معقمة أيضاً ثم يتم حقن كل أنبوبة بقدر مناسب من المادة المعقمة بالترشيح للبيئة الغذائية السابقة التعقيم بالأتوكلاف.
ويجب أن تكون البيئة غير صلبة وعليه أن يتوفر بمعمل زراعة الأنسجة حمامات مائية أو ميكروويف لصهر البيئة حتى يمكن خلط المواد ( مثل الجبرلين ) المعقم بالترشيح بباقى البيئة التى يجب ألا يزيد درجة حرارتها عن 40 درجة مئوية . ولإتمام عمليات التعقيم بسهولة ويسر يجب توفر سلات لنقل الأنابيب والدوارق داخل الأتوكلاف . كذلك يجب توفر صوانى وحوامل أنابيب ووسائل تعليم الزجاجيات حتى لا تختلط وتفقد هويتها بعد الخروج من الأوتوكلاف .
6- الزراعة والنقل Culture incubation and transfer
عزل وزراعة الخلايا أو الأنسجة يجب كما سبق الإشارة إليه أن يتم فى جو غاية فى النظافة ويمكن أن يتم ذلك باستخدام كابينة Laminar air flow مزودة بفلتر يمرر خلاله هواء مضغوط يؤدى إلى خروج الهواء لحيز الكابينة وهو خالى من الكائنات الدقيقة التى تتواجد فى الهواء العادى ، وبالطبع يجب أن توضع كابينة العزل فى مكان نظيف ويفضل أن تكون حجرة ذات أبواب مزدوجة Double sliding doors وذلك لتقليل الأتربة Atmospheric duct فى جو حجرة العزل .
وعادة للمحافظة على فلتر كابينة العزل ينظف من آن إلى آخر وذلك بشفطه ميكانيكياً أو غسله، وتزود كابينة التعقيم بمصدر للإضاءة وكذلك مصدر للكهرباء لتوصيل الميكروسكوب عند الرغبة فى استخدامه ولزيادة الحيطة وخوفاً من التلوث يستخدم القائم بالعمل قفازات بلاستيكية كما يمكن استخدام ملابس معقمة خاصة بالعمل، وترجع أهمية القفازات إلى حماية البشرة من الجفاف الناتج من استخدام الكحول فى تعقيم الأيدى قبل إجراء الزراعة، كذلك تستخدم الملابس المعقمة لتقليل التلوث من الملابس الشخصية للقائم بالعمل.
وتستخدم أدوات العزل وفصل الأنسجة Surgical instruments مثل الملاقط Forceps ، ملعقة الصيدلى Spatula ، الإبر Needles ، المشرط Scalpel ، المقص Scissor فى فصل Explant ونقلها على سطح البيئة الغذائية وتعقم تلك الأدوات باستخدام Sterilizer الخاص بذلك أو بغمس الأدوات فى كحول وحرقها على النار باستخدام موقد كحولى Spirit lamp أو موقد بنزين Bunsen burner كذلك يجب وضع رشاشة كحول Spray bottle of alcohol لرش الكحول على أسطح كابينة العزل لتعقيم اسطحها فى بداية العمل ويترك الجهاز لمدة نصف ساعة للتأكد من نظافتها قبل استعمالها .
7- التحضين Culture incubation
تحضن الأنابيب أو الدوارق داخل حجرة ذات أرفف أو داخل حضانة متسعة ومزودة بالإضاءة والحجرة تحتوى على مكيف للهواء للتحكم فى درجة الحرارة وتزود حجرة التحضين بقاطع للتيار الكهربى Cut out device ومنبه Alarm bell يعمل إذا ارتفعت درجة الحرارة أكثر من المعدل المطلوب بدرجتين إلى ثلاث درجات مئوية وتزود حجرة التحضين بهزاز Shaker لتوفير التهوية للبيئات السائلة كما تزود حجرة التحضين بميقاتى Timer switch لتحديد زمن الإضاءة والإظلام وعادة ما تتعرض الزراعات لمدة 16 ساعة إضاءة يومياً وثمان ساعات إظلام أما بالنسبة للرطوبة فيجب ألا تزيد عن 70 % وذلك لأن زيادتها تزيد من فرص التلوث ونقصها أيضاً غير ملائم نظراً لإسراع البيئة الغذائية Drying out of culture medium .
8- عملية النقل للجو الخارجى In vivo transfer
تنقل النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة إلى الجو الخارجى تدريجياً بدأ بالصوبة الزجاجية Glasshouse أو Screen house أو داخل أحواض خاصة Horticultural propagator ثم إلى الحقل . والتدرج فى الانتقال هام حيث أنه ينقل نباتات نامية فى جو مائى أوشبه مائى إلى جو عادى لذلك يجب أن تعامل النباتات معاملات التقسية التى من شأنها أن تتيح للنباتات مقدرة على تحمل الظروف خارج الأنبوبة وذلك بتعريض النباتات لشدة إضاءة تصل إلى 10000 Lux مع فتح الأنابيب عدة مرات قبل نقلها ثم تنقل النباتات مباشرة إلى أصص بلاستيك أو Jiffy 7 مملوء بمخلوط زراعى مناسب معقم Sterilized compost وتنقل النباتات إلى الصوبة تحت رى رزازى Mist أو داخل الأحواض ذات الأرضية الشفافة أو توضع الأصص داخل أكياس من البلاستيك ثم تدريجياً تقلل الرطوبة إلى الجو العادى ، أما عند تصدير النباتات Plantlets إلى الخارج عادة يستخدم تغليف خاص Polystyrene boxes وتفحص لخلوها من الأمراض قبل تصديرها .
6- ملخص لاحتياجات معمل زراعة الأنسجة
1- عام General
- تجهيزات كهربائية ومولد كهربائى للطوارئ
Generator Electric supply with emergency
- مصدر مائى Main water source
- مصدر للغاز Gas supply
- مكيف هواء Air condition
- مناضد Benching
- طفاية حريق Fire Extinguisher
2- الغسيل Washing up
- حوض مزدوج كبير الحجم Double sink large size
- مصدر مائى ساخن وبارد Hot and cold water supply
- حوامل للتجفيف Draining rack
- زجاجات للتنظيف Bottle brushes
- كابينة أو فرن للتجفيف Hot air drying cabinet or oven
- صندوق للنفايات Waste bins
- بالطو وقفازات Waterproof apron and gloves
- جمدانة مياه Glass / plastic covered containers for distilled water
- حامل للمناشف Towel holder
- منظفات وصابون Detergent , chemical decontaminant and soap
- ماكينة غسيل أتوماتيكية Glassware washing machine
- جهاز تقطير مياه بالفصل الكهربى Water de-ionizer
3- إعداد البيئة وتخزينها media preparation and storage
- أرفف للكيماويات Shelves for chemicals
- دولاب للكيماويات Chemical capboard
- ثلاجة Refrigerator
- مبرد تحت الصفر Deep Freezer
- مجفف Desiccator
- ميزان حساسيته 0.1 مليجرام Balance accurate to 0.1 mg
- قوارب للوزن Weighing balance boat
- معلقة الصيدلى Spatula
- مقلب مغناطيسى Magnetic stirrer / hot plate
- جهاز تقدير أيون الأيدروجين PH meter with buffers and adjusting solution
- ترمومتر Thermometer
- دوارق مخروطية Conical flask 100, 250, 500, 1000 ml
- دوارق مخروطية Volumetric flask 100
- كاساتBeckers 1000 – 2000 ml
- أقماع Funnels
- مضخة ماء Water jet pump
- ماصة مدرجة Graduated pipettes 1, 2, 5, 10 ml
- ماصة أتوماتيكية Automatic pipettes
- سرنجة Syringe
- زجاجات الزراعة Culture vessels , tubes, flasks bottles
- سبت سلك Wire baskets for carrying bottles and tube
- أتوكلاف Autoclave
- صوانى Trays
- ورق ألومنيوم Aluminum foil
- قلم للكتابة على الزجاج ضد الماء Waterproof makers
- حمام مائى Water bath
- جهاز طرد مركزى Low speed centrifuge
1- عام General
- تجهيزات كهربائية ومولد كهربائى للطوارئ
Generator Electric supply with emergency
- مصدر مائى Main water source
- مصدر للغاز Gas supply
- مكيف هواء Air condition
- مناضد Benching
- طفاية حريق Fire Extinguisher
2- الغسيل Washing up
- حوض مزدوج كبير الحجم Double sink large size
- مصدر مائى ساخن وبارد Hot and cold water supply
- حوامل للتجفيف Draining rack
- زجاجات للتنظيف Bottle brushes
- كابينة أو فرن للتجفيف Hot air drying cabinet or oven
- صندوق للنفايات Waste bins
- بالطو وقفازات Waterproof apron and gloves
- جمدانة مياه Glass / plastic covered containers for distilled water
- حامل للمناشف Towel holder
- منظفات وصابون Detergent , chemical decontaminant and soap
- ماكينة غسيل أتوماتيكية Glassware washing machine
- جهاز تقطير مياه بالفصل الكهربى Water de-ionizer
3- إعداد البيئة وتخزينها media preparation and storage
- أرفف للكيماويات Shelves for chemicals
- دولاب للكيماويات Chemical capboard
- ثلاجة Refrigerator
- مبرد تحت الصفر Deep Freezer
- مجفف Desiccator
- ميزان حساسيته 0.1 مليجرام Balance accurate to 0.1 mg
- قوارب للوزن Weighing balance boat
- معلقة الصيدلى Spatula
- مقلب مغناطيسى Magnetic stirrer / hot plate
- جهاز تقدير أيون الأيدروجين PH meter with buffers and adjusting solution
- ترمومتر Thermometer
- دوارق مخروطية Conical flask 100, 250, 500, 1000 ml
- دوارق مخروطية Volumetric flask 100
- كاساتBeckers 1000 – 2000 ml
- أقماع Funnels
- مضخة ماء Water jet pump
- ماصة مدرجة Graduated pipettes 1, 2, 5, 10 ml
- ماصة أتوماتيكية Automatic pipettes
- سرنجة Syringe
- زجاجات الزراعة Culture vessels , tubes, flasks bottles
- سبت سلك Wire baskets for carrying bottles and tube
- أتوكلاف Autoclave
- صوانى Trays
- ورق ألومنيوم Aluminum foil
- قلم للكتابة على الزجاج ضد الماء Waterproof makers
- حمام مائى Water bath
- جهاز طرد مركزى Low speed centrifuge
4- أدوات عزل وزراعة الأنسجة Culture incubation and transfer instrument
- ماصة أتوماتيكية Automatic pipettes
- سرنجة Syringes : 1 ml, 10 ml, 20 ml
- زجاجات الزراعة Culture vessels , tubes, flasks bottles
- زجاجات ذات قمة لوبية Glass screw tap battles ; 250 , 500 , 1 ml
- قنينة بلاستيك Plastic vials : 10 ml , 20 ml
- سبت بلاستيك Wire baskets for carrying bottles and tube
- أتوكلاف Autoclave
- صوانى Trays
- ورق ألومنيوم Aluminum foil
- قلم للكتابة على الزجاج ضد الماء Waterproof makers
- فرن حرارى للتعقيم Heat sterilizing oven
- حمام مائى Water bath
- جهاز طرد مركزى Low speed centrifuge
- حلة ضغط Pressure ****e
5 - أدوات عزل وزراعة الأنسجة Culture incubation and transfer instrument
- كابينة عزل Laminar air flow cabinet
- مشرط Scalpel
- معلقة الصيدلى Spatula
-الإبر Needles
- مقص Scissors
- موقد كحولى Spirit lamp
- ميكروسكوب بمصدر ضوئى Dissecting microscope
- قفازات Gloves
- بارافيلم Para film
6- التحضين Incubation
- حجرة أو كابينة متحكم فيها درجة الحرارة والرطوبة Room cabinet with temperature and humidity control
- أرفف مضاءة Shelving with light
- حوامل أنابيب Test tube racks
- هزاز Shaker
- النقل الجوى للخارج In vitro transfer
- أصص Plant pots
- صوانى Trays
- علامات Plane labels
- حوض زراعة Horticultural propagator
- كاسات أو أكياس بلاستيك Beakers or plastic bags
- وسط للزراعة Compost
- سماد سائل Liquid fertilized
- جهاز الرى الرزازى Mist propagator or high humidity chamber
